Em 1922, época do Centenário da Independência, o caráter histórico da instituição foi reforçado, quando novos acervos foram criados, com destaque para a História de São Paulo. A decoração interna do edifício foi criada, com pinturas e esculturas apresentando a História do Brasil no Saguão, Escadaria e Salão Nobre. Também foi inaugurado o Museu Republicano "Convenção de Itu", extensão do Museu Paulista no interior paulista.

Ao longo do tempo, houve uma série de transferências de acervos para diferentes instituições. A última delas foi em 1989, para o Museu de Arqueologia e Etnologia da USP. A partir daí, a instituição vem ampliando seus acervos referentes ao período de 1850 a 1950 em São Paulo.

Como órgão da Universidade de São Paulo desde 1963, o museu exerce pesquisa, ensino e extensão. Até seu fechamento para reformas, o Museu Paulista possuía um acervo de mais de 125.000 unidades, entre objetos, iconografia e documentação textual, do século XVII até meados do século XX, significativo para a compreensão da sociedade brasileira, especialmente no que se refere à história paulista e conta com uma equipe especializada de curadoria. Desenvolve também um Projeto de Ampliação de seus espaços físicos.